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  N-糖基化修饰蛋白质组学

N糖基化是最主要的PTM之一,并且在有机体中复杂分子的装配中起着重要作用。这种修饰涉及到大量的细胞的功能,包括细胞与细胞的连接,受体配体的相互作用,免疫应答、细胞凋亡以及各种发病机理。N糖基化主要发生在内质网以及高尔基体且修饰的位点具有特异性。尽管大量的生物学实验和临床研究,我们对有机体内N糖基化修饰位点的条件和对应的功能有一定的了解但仍然有局限性的。在大量糖分子附加的复杂性和许多N-glycoproteins低表达水平使得对N-glycosylation结构的表征的描述极为困难。在检测低丰度的N糖基化修饰蛋白或肽段时,其中参杂这大量的未修饰的蛋白肽段,这很容易将低丰度的糖基化修饰蛋白肽段的信号掩盖,目前采用凝集素亲和富集能够解决这一问题。

技术原理

大多数的N端糖基化修饰发生在膜蛋白上,这些蛋白在蛋白质组学分析的是较难处理的。我们目前选用基于FASP(filter aided sample preparation)技术的原理,该技术不像传统2D蛋白质组学,需跑SDS-PAGE胶。FASP技术能够通过亲和试剂-凝集素富集糖基化修饰肽段。在蛋白酶解之后,凝集素富集糖基化修饰肽段,非糖基化修饰肽段即可被Washbuffer冲洗掉。通过PNGaseF去糖基化酶,在去糖基化这一步骤中选用的是18O-水贯穿整个实验,在这一处理中糖基化修饰位点上分子量发生2.9890 Da的偏移相比较普通水作用后分子量只偏移0.9858 Da,之后再将糖基化肽段冲洗下来,并进行LC-MS/MS分析。在酶解过程中我们使用trypsin 和 Glu-C两种酶进行酶解,这样增加鉴定到糖基化修饰位点的数量及可信度。在实验中,一般选用40ul左右约200ug的蛋白进行实验,当然样品量可以成比例的增加。

为了获取三大类的N端糖基化修饰肽段,我们希望采用多种类型的凝集素进行富集。凝集素本身并不需要与载体连接,因为它无法穿过过滤膜。我们选用ConA能与甘露糖亲和,WGA能与唾液酸结合,RCA凝集素与N端乙酰氨基葡萄糖能与在3-0的修饰位点上的半乳糖结合。采用多种凝集素富集的方法比采用单一凝集素富集的效率明显是要高的。N端糖基化修饰位点在单次质谱实验通过多种凝集素的富集的肽段中有63%能够检测到。相比通过单一凝集素富集三次质谱能够检测到69%的修饰位点。WGA被证明在凝集素中具有最好的亲和富集效率。糖基化肽段在PNGase酶处理后去糖基化的肽段占46%分布。这个实验鉴定到糖基化的肽段的比率相比磷酸化修饰和乙酰化修饰嗾使要高很多的。在没有凝集素的富集下,大约只有0.5%的糖基化肽段,表明凝集素富集能够提升约100倍的鉴定结果。

为了精密的N端糖基化修饰位点谱图的绘制,在质谱分析中采用LTQ-Obitrap质谱仪进行母离子分析。常用的母离子碎裂方式有CID/HCD,早先HCD方式虽分辨率高,但牺牲了灵敏度,原采用Velos设备,它将HCD碎裂方式的性能增加20倍。HCD与CID相较而言,HCD方式能够更真实的表现样本情况,现如今本公司采用Obitrap-Elite仪器,分辨率高灵敏度都得到了进一步提高了。

样品要求

  1. 动物组织的样品量湿重不少于200mg。
  2. 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2g。
  3. 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。
  4. 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10mL以上,要保证不能溶血;血清要求500μl以上;尿液要求50mL以上。
  5. 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2 mg/mL,总量不少于1 mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。
  6. 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。
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