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  泛素化修饰蛋白质组学

泛素由76个氨基酸组成,高度保守,普遍存在于真核细胞内,故名泛素。泛素化是可逆的,依赖ATP并且通过泛素激活酶E1,泛素结合酶E2,泛素连接酶E3一系列催化反应所致。这些特殊的酶包括泛素激活酶,结合酶、连结酶和降解酶等。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时,它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关。因此,作为近年来生物化学研究的一个重大成果,它已然成为研究、开发新药物的新靶点。

泛素化可以生产出单泛素化或多泛素化蛋白质。后者在当7个赖氨酸残基的泛素与另一个泛素的甘氨酸C端连接形成。这种泛素分子链接在生物过程中起到重要的作用。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解,这是细胞内短寿命蛋白质和一些异常蛋白降解的普遍途径。泛素化及类泛素化蛋白在细胞分裂,自噬,DNA修复,免疫应答,细胞消亡等方面同样起到关键作用。与消化道内进行的蛋白质水解不同,从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段,整个水解过程需要能量参与。人们开始意识到泛素-蛋白酶系统是一个对于真核细胞非常重要的调节系统。

技术原理

尽管质谱仪器的分析能力近年来有了长足的发展,但是由于蛋白翻译后修饰化学计量值低、复杂性大,直接将蛋白组(如全细胞裂解产物,组织匀浆产物或全血清蛋白)的酶解肽段送入质谱鉴定和定量PTM是非常困难的。因此,很多翻译后修饰的富集方法会被采用,来提高样品中PTM肽段的丰度和相对比例,从而提高了质谱对翻译后修饰位点的鉴定效率。研究发现在泛素化修饰的蛋白在tyrpsin的作用下都会产生diGly位点。基于这一特异性,利用Cell Signaling Technology (CST)公司开发的针对蛋白质翻译后修饰(PTM)基序(motif)抗体,在肽段水平上免疫亲和富集带有泛素化修饰的肽段,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行定量分析,能够快速、准确、高通量地分析多种疾病相关信号通路关键节点蛋白修饰的变化,满足创新性研究、生物标志物鉴定、药物靶点筛选和评价的需求。

样品要求

  1. 动物组织的样品量湿重不少于200mg。
  2. 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2g。
  3. 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。
  4. 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10mL以上,要保证不能溶血;血清要求500μl以上;尿液要求50mL以上。
  5. 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2 mg/mL,总量不少于1 mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。
  6. 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。
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