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  乙酰修饰蛋白质组学

翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程。它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团,可以改变蛋白质的物理、化学性质,进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用。尽管质谱仪器的分析能力近年来有了长足的发展,但是由于蛋白翻译后修饰化学计量值低、复杂性大,直接将蛋白组(如全细胞裂解产物,组织匀浆产物或全血清蛋白)的酶解肽段送入质谱鉴定和定量PTM是非常困难的。因此,很多翻译后修饰的富集方法会被采用,来提高样品中PTM肽段的丰度和相对比例,从而提高了质谱对翻译后修饰位点的鉴定效率。

蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下,蛋白质的赖氨酸残基上添加乙酰基的过程,是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一种机制。乙酰化修饰功能主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面 。近年来,通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现,在生理状况下,存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰,具有广泛的生物学意义。

(1)乙酰化修饰普遍存在于人体的代谢酶之中,具有调节代谢通路及代谢酶的活性。

(2)乙酰化对代谢的调控在生命进化过程中极为保守,广泛存在于从低等原核细胞到包括人在内的高等哺乳动物的翻译后修饰过程中。

(3)蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性,与肿瘤等等疾病密切相关,这为开发代谢类疾病的药物研发提供了重要依据和全新思路。

研究方法

定性

(1) 利用可以纯化乙酰化底物的抗体(CST的PTMScan Motif Antibody )富集并利用高通量质谱检测(Orbitrap-Elite/Fusion),该方案具有高灵敏度及高特异性。

定量

(1) iTRAQ定量:将iTRAQ蛋白定量技术和蛋白质修饰富集技术相结合,可对2-8种生物样本中乙酰化修饰进行相对定量

(2)SILAC定量:结合SILAC标记技术和蛋白质修饰抗体富集技术相结合,对细胞样本中乙酰化修饰进行相对定量。

(3)非标记(Label-free)定量:将非标记(Label-free)定量技术用于蛋白质翻译后修饰的相对定量,无需昂贵的稳定同位素标记试剂但定量受样本数量限制。

技术流程

样本要求

  1. 动物组织的样品量湿重不少于200mg。
  2. 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2g。
  3. 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。
  4. 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10mL以上,要保证不能溶血;血清要求500μl以上;尿液要求50mL以上。
  5. 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2 mg/mL,总量不少于1 mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。
  6. 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。
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