LOGO
当前位置: 首页 > 组学服务 > 蛋白质组学服务 > 蛋白质翻译后修饰位点分析
  蛋白质翻译后修饰位点分析
蛋白质翻译后修饰位点质谱分析
Mass spectrometry analysis of protein posttranslational modification(PTM)site

蛋白质翻译后修饰(Protein post-Translational Modification,PTM)在生命体中具有十分重要的作用。蛋白质翻译后修饰通过影响基因表达,信号传导通路、细胞分裂进程等从而与性状表达过程密切相关。蛋白质翻译后修饰在体内是一个动态的变化过程,同一蛋白在不同生理状态、不同亚细胞定位、不同氨基酸位点的修饰,可能对应其不同的功能,因此有效探明细胞和组织内蛋白质修饰谱是当今功能蛋白质组学研究的重要内容,是当前的一个研究热点和难点。

现有的检测蛋白质翻译后修饰的实验方法还不能高通量地针对多种修饰种类,基于蛋白质序列的生物信息学法预测翻译后修饰又面临着不能反映体内动态修饰的难题。蛋白质组高通量质谱数据和生物信息学分析方法的结合,有可能弥补各自的缺点,使研究生物样本在某一状态下的翻译后修饰变化全貌成为可能。这样既可能得到蛋白质组规模的翻译后修饰图谱,又为分子机制的研究以及生物标志物的发现带来新的希望,拓展了翻译后修饰研究的新领域。

技术原理

一般情况下,前体蛋白质需要经过一系列的翻译后加工才能形成具有功能的成熟蛋白质。化学修饰是蛋白质翻译后修饰的主要方式,其最常见的修饰类型主要有磷酸化(Phospho- rylation,P)、甲基化(Methylation, Me)、乙酰化(Acetylation,Ac),泛素化(Ubiquitylation,Ub)和SUMO化(Sumoylation,Su)。

不同修饰的蛋白质经过酶解形成肽段。因为修饰蛋白质(肽段)在总蛋白质(肽段)中的相对含量较低,所以在进行质谱分析之前,一般先对修饰肽段进行富集(Enrichment)。比如乙酰化肽段一般利用特异的乙酰化抗体、磷酸化肽段则可以使用iMAC和TiO2、糖肽使用凝集素来进行富集(图2)。富集主要有两个目前:首先提高了修饰肽段的相对含量,其次避免了非修饰肽段的影响。

一般一种特定的翻译后修饰通常会作用于一定的氨基酸,并且经过修饰后,这一类氨基酸会增加相同的分子量,见图1,比如磷酸化一般作用于肽段上的丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)和酪氨酸(Tyr,Y)三个位点。磷酸化肽因为加入了磷酸化基团而产生+80Da的质量偏移。翻译后修饰引起的肽段质量偏移变现为修饰蛋白质在质谱峰中相应的漂移,质谱通过检测多肽离子片段的质量鉴定肽段,可能检测出翻译后修饰导致的质量偏移,进而识别发生翻译后修饰的蛋白。

技术特点

  1. 灵敏度高,蛋白质浓度最低可在fmol级别
  2. 不需要特别进行纯化的蛋白质
  3. 与传统方法相比,没有放射性的危险
  4. 通量高
  5. 准确性高

FAQ

  1. 对样品的要求?
    除了磷酸化修饰以外,其余的修饰类型要求是经过纯化的纯蛋白。磷酸化修饰我们可以进行富集工作。纯化样品如果是PAGE Band,只要肉眼可见即可。
     
  2. 质谱鉴定得到的修饰位点是否是直接证据?
    鉴定结果里面会反馈是哪个位点发生修饰,该修饰位点的可能性,并不是直接证据。需要后期或者前期的实验区证明,比如目标蛋白质的修饰抗体,或者广谱的修饰抗体和目标蛋白质的常规抗体的组合等。
     

参考文献

  1. Witze ES1, Old WM, Resing KA et al. Mapping protein post-translational modifications with mass spectrometry. Nat Methods 4(10):798-806. (2007)
  2. Jensen ON. Interpreting the protein language using proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 7(6):391-403. (2006)
  3. Macek B1, Mann M, Olsen JV. Global and site-specific quantitative phosphoproteomics: principles and applications. Annu Rev Pharmacol Toxicol 49:199-221. (2009)
  4. Choudhary C, Mann M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 11(6):427-39. (2010)
  5. Molina H, Horn DM, Tang N et al. Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 104(7):2199-204. (2007)
-------------------------------------------------------------------------

微信扫一扫,加我们的公众号,可以有更多的信息。

招贤纳士  |   合作伙伴  |   企业文化  |   公司介绍  |   访问次数: Website Hit Counters
上海生咨生物科技有限公司版权所有 沪ICP备14048106号