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  Label-free非标记定量技术

在非标记策略的定量模型中,主要涉及两种不同的算法:其一,以肽段的色谱峰积分面积为基础,通过比较一对生物样品中相对应到蛋白质酶解多肽的色谱积分面积而得到两者的相对丰度;其二,以肽段被质谱检测的计数为基础,通过归一化来表征被检测蛋白质的相对丰度。非标记技术认为肽段在质谱中被捕获检测的频率(Counts)与其在混合物中的丰度成正相关,因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度,通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来,从而对蛋白质进行定量。

蛋白质非标记定量技术(label-free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

技术原理

在非标记定量策略的两种算法中,基于肽段被检测到次数的算法得到的肽段定量较色谱峰面积的算法有好的重现性(Reproducible)和动态范围(Dynamic range),但是后期需要较为复杂的算法(Alignment)和均一化方法(Normalization method)。基于现代高灵敏度质谱(High resolution of modern spectrometers)结果的分析软件Maxquant综合了以上两种定量方法的优点:以一级质谱(MS1,肽段水平)为基础,将质谱数据转化成以色谱保留时间(Retention time)和质荷比(m/z)为变量的二维图谱,在该二维图谱基础加上MS1肽段的强度(Intensity)变量,即最原始的质谱数据最终被转换成形象的三维图谱。

在每个样本的质谱实验中,最后的实验结果均可表现为一张二维图谱,二维图谱中的每个点对应一个肽段,根据三维图谱中的峰积分计算出该点(肽段)的强度,通过比对不同样本对应的肽段强度,可达到对肽段和蛋白质进行相对定量的目的。

技术特点

对质谱仪器设备要求较高,色谱和质谱需要同时有较好的稳定性和重复性。
需要有特殊的定量分析软件。
对样品中蛋白质总量要求较低,实验周期短,实验费用低。
不需要额外并且昂贵的标记试剂,排除了标记过程带入实验误差的风险,同时也不必考虑标记效率的问题。

实验步骤

 

与标记定量技术的比较

iTRAQ和TMT技术,由于标记后可以提高肽段离子化效率,利于鉴定到更多蛋白质;基于低分子量端来进行定量,定量结果更准确;最多可以同时完成10个样品的质谱定量分析。Label-free技术,对样本的操作最少,并且不受样品条件的限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。但对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高。Label-free方案蛋白质不需要进行标记,所需要的样品总量较iTRAQ和TMT方案少。

样品要求

样品类型 样品要求
蛋白质提取物 浓度 >1μg/μl,蛋白质总量 >200μg;
细胞样品 细胞量>107
组织样品 动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg
体液样品 血液体积>500μl

参考文献

  1. WM Old-2005-Molecular&Cellular Proteomics-Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by shotgun proteomics.
  2. SJ Callister-2006-Journal of Proteome Research-Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics.
  3. AS Haqqani-2008-Genomics Protocols-Quantitative protein profiling by mass spectrometry using label-free proteomics.
  4. H Choi-2008-Molecular & cellular proteomics-Significance analysis of spectral count data in label-free shotgun proteomics.
  5. VJ Patel-2009-Journal of Proteome Research-A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.
  6. NM Griffin-2010-NATURE BIOTECHNOLOGY-Label-free, normalized quantification of complex mass spectrometry data for proteomic analysis.
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