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  iTRAQ标记定量方法

iTRAQ标记定量方法蛋白鉴定是Shotgun技术的衍生,是目前JPR和MCP杂志最流行的差异蛋白质组鉴定路线。iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)2004年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,是一种建立在iTRAQ试剂的基础上可同时对八种样品进行绝对和相对定量研究的方法。iTRAQ标记定量方法的核心思想是蛋白鉴定前,全部酶切,通过液相分离和质谱鉴定有效肽段,确定蛋白的鉴定。同时利用iTRAQ标记的肽段来确定不同样品中,同一个蛋白的比值变化。iTRAQ标记定量方法的核心思想是蛋白鉴定前,全部酶切,通过液相分离和质谱鉴定有效肽段,确定蛋白的鉴定。同时利用iTRAQ标记的肽段来确定不同样品中,同一个蛋白的比值变化。

 

技术原理

iTRAQ实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。iTRAQ试剂主要由3部分组成:报告基团(Report group)、平衡基团(Balance group)和肽反应基团(Amine-specific reactive group)。以4标试剂为例:报告基团相对分子质量分别为114、115、116和117;平衡基团相对分子质量分别为31、30、29和28,肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸(Lysine,K)及N端氨基酸残基相连,在其上4种报告基团通过平衡基团与反应基团相连,这样就形成了4种相对分子质量均为145的等量异位标签。

iTRAQ试剂在标记肽段样本后,报告基团和平衡基团的平衡分子量都为145,因此改变任一iTRAQ试剂,不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测中分子量都完全相同。而在串联质谱(MSMS)中,同重元素标记肽段的报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的连接键断裂,平衡基团中性丢失,同时不同同位素标签的同一肽段产生不同的质荷比(114-117)的峰。因此,根据波峰的高度和面积,可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到肽段和蛋白质的定量信息。

技术特点

  1. 较双向电泳(2D Electrophoresis)优势
    iTRAQ技术不仅可以发现到更多的胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白,同时还可以检测到2D技术较难发现的低丰度蛋白、疏水性蛋白、等电点极酸和极碱蛋白、分子量极低极高蛋白(小于10kDa或大于200KDa)。
  2. 分析时间快、实验误差小
    可在一次实验中同时完成最多8组样本的比较,不仅减少了实验误差和缩短了实验周期,而且增加了实验统计的相关性。
  3. 分析范围广
    iTRAQ试剂几乎可以与样本中所有的蛋白结合,同时因为是体外标记,所以对各种动植物组织、微生物、血液、体液、细胞培养物以及分泌物等样本均可进行分析。
  4. 可信度高
    现代串联质谱具备扫描速度快、精度高等特点,使其二级碎片离子信号增强,产生质量更高的二级质谱,确保鉴定结果高的可信度。同时,标记试剂的报告离子的相对分子质量较低(均不超过121),低分子量区是质谱定性和定量较为准确的区域,因此检测结果更为灵敏可靠。
  5. 翻译后修饰分析
    保留了肽段转录后修饰的状态,因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性和定量研究。

技术流程

交付报告

  1. 预实验报告
  2. 正式实验报告
  3. 生物信息学分析报告
  4. 原始质谱数据

样本要求

样本类型 样本要求
蛋白质提取物 浓度 >1μg/μl,蛋白质总量 >300μg
细胞样品细胞量 >107
组织样品 动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg
体液样品 血液体积>500μl

FAQ

  1. 关于样品重复的问题?
    最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复,比如有A和B两组,最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品;其次是技术重复,只有A和B两个样本,没有生物学重复,推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复,还可以有一些其他考虑:如果实验本身在整个研究中处于后期的验证,或者是一个前期的开始,可以考虑1次重复;类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计,一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证,比如Realtime-PCR,Western-Blot,ELISA等。
  2. iTRAQ实验对样品的要求?
    a.植物类叶片样本:湿重≥1g;
    b.植物富含杂质或蛋白含量低的样本,如植物根,根茎、木质部、韧皮部组织等:干重≥5g;
    c.细胞样本数目须达到:107(建议使用我们的裂解液进行裂解之后再进行寄送);
    d.新鲜人,动物组织:≥100mg;
    e.血清/血浆≥500µl;
    f.尿液≥25mL;
    g.唾液、羊水、脑脊液等体液≥5mL;
    h.其他特殊样本如有疑问请联系我们。
  3. iTRAQ实验一次可以做多少个样本?
    理论上利用一个8标试剂盒,一次实验最多可以做8个样本。但如果在所有的实验里面设置内标的话,就可以把多个8标实验关联起来,这样就可以做超过8个样本的iTRAQ实验了。
  4. 通过iTRAQ找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗?
    做为一个高通量的实验,iTRAQ最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白,对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据,是一个“发现”过程,需要后期通过其他的实验区再次验证。所以,在一个iTRAQ实验开始之前,我们不会就某个特殊的蛋白质的检出,以及显著性和变化倍数等做出保证。
  5. 为什么要设计预备实验?
    设置预备实验室将整个iTRAQ实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本,即便在SDS-PAGE图,以及质谱的Basepeak图都是一样的,可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大,出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染,如果没有预备实验,这样的情况可能会比较难排查。

参考文献

  1. L.Oudenhove-2013-Appl Microbiol Biotechnol-A review on recent developments in mass spectrometry instrumentation and quantitative tools advancing bacterial proteomics.
  2. T.Veenstra-2007-Journal of Chromatography-Global and targeted quantitative proteomics for biomarker discovery.
  3. A.Bachi-2008-Jounal of Proteomics-Quantitative proteomics as a new piece of the systems biology puzzle.
  4. B.Domon1-2010-Nature biotechnology-Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy.
  5. F.Meissner-2014-NATURE IMMUNOLOGY-Quantitative shotgun proteomics_ considerations for a high-quality workflow in immunology.
  6. S.Ong-2005-Nature chemical biology-Mass spectrometry–based proteomics turns quantitative.
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