LOGO
当前位置: 首页 > 组学服务 > 蛋白质组学服务 > 2D-LC非标记定量
  2D-LC非标记定量

1. 样品前处理

可参考文献的处理方法,如无特殊需要则采用经典的组织器官蛋白提取方法。(请提供一个常用的Protocol,客户需要提供哪几个方式的样本,样本量需要多少,样本运输需要注意什么)

2. 蛋白样品的定量与酶解

以4组样品为例。每组样品重溶,Bradford蛋白定量,按蛋白量等量取样,形成4组蛋白含量相等的样品。可取剩余蛋白进行1次SDS分离,检测蛋白提取的情况,以及样品的复杂程度。使用溶液酶解方法进行酶解,最终获得肽段干粉(进行还原烷基化酶解,提高蛋白覆盖率)之后进行2DLC实验。定量和酶解的方法与步骤,参照权威文献protocol(提供protocol文件,或者下载连接(蛋白质化学与蛋白质组学,夏其昌主编,2004年定量参见278页,酶解参见181页。或者参考发表在MCP,JPR,Proteomics等杂志上的相关文章。))

3. 两维nano-HPLC色谱分离

使用纳升级高效液相系统进行在线两维分离,使用ThermoFisher公司 LTQ Obitrap XL质谱系统进行数据采集。

两维实验中,第一维采用强阳离子交换,可根据样品复杂程度设置6-12个梯度,第二维为反相液相色谱,使用60分钟进行分离及平衡,同时质谱检测。4组样品按照每组样品重复3次,8个第一维梯度,第二维60分钟计算,共需96小时的检测、数据采集时间。

4. LTQ-Orbitrap质谱检测

质谱系统

ThermoFisher公司 LTQ Obitrap XL Nano离子源,喷雾电压1.6kV;质谱扫描时间60min;实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion);扫描范围400-1800m/z;一级扫描(MS)使用Obitrap,分辨率设定为60000;CID及二级扫描使用LTQ;在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除,不作为母离子)。

预期实验结果(示例):

总离子色谱图(total ions chromatography)


总离子色谱图(total ions chromatography)

基峰色谱图(base peak chromatography)

基峰色谱图(base peak chromatography)

MS图;其相应MS/MS图


MS图;其相应MS/MS图
MS图;其相应MS/MS图

5. 数据分析

5.1 使用数据分析软件BioworksBrowser 3.3.1 SP1进行Sequest™检索,检索数据库为Uniprot_sprot数据库,或IPI数据库。母离子误差设定为100ppm,碎片离子误差设为1Da,酶切方式为半酶切。检索结果使用ThermoFisher公司SIEVE软件进行卡值过滤,同时进行相对定量。

5.2 寻找差异蛋白,差异两倍以上记为显著。差异蛋白列表结果示例如下:

提供下列数据及参数:

  • 实验中用到的所有重要设备的制造厂商,型号,操作参数
  • 样品前处理的相关数据
  • 2DLC,LC-MS/MS所有的原始数据
  • 数据分析得到的各项数据结果,包括相关数据统计表以及分析结果图的截图
  • 质谱分析的搜索结果文件,质谱的峰图文件

以上各项结果我们将以电子格式提供。查库后列表说明差异蛋白的名称、PI点、分子量、氨基酸个数、gene symbol。可根据蛋白质列表进行GO分类(gene Ontology),对指定蛋白进行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析。

-------------------------------------------------------------------------

微信扫一扫,加我们的公众号,可以有更多的信息。

招贤纳士  |   合作伙伴  |   企业文化  |   公司介绍  |   访问次数: Website Hit Counters
上海生咨生物科技有限公司版权所有 沪ICP备14048106号